大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是中国特有的珍稀野生保护动物，随着大熊猫数量增加，大熊猫疾病救治的压力也随之增大。在大熊猫疾病救治及野外抢救中，输血治疗十分重要。临床输血中关乎输血安全及有效性的核心问题是血型配合，人类血型的研究已相当透彻，其他家养动物的血型系统，也有较深入研究。大熊猫血型系统研究甚少，报道仅仅见于大熊猫输血急救的案例报道中[1-8]，故而国内外尚无针对大熊猫红细胞分型的结论，亦缺乏大熊猫血型系统的定型试剂。

人类血型定型实验中，常使用同源性抗血清(多克隆抗体)及异源性单、多克隆血型定型抗体对红细胞进行定型实验。在探索大熊猫红细胞血型抗原的研究中，已有研究人员使用人类血清学血型试剂作为大熊猫红细胞血型定型试剂对大熊猫红细胞进行血型分型得到以下结论：在刁玉英等的研究中，使用人源性抗血清作为定型试剂对大熊猫红细胞进行检测，发现大熊猫与人源性抗M血清发生凝集，得到大熊猫红细胞具有M抗原的结论[8]；在随后的研究中，蔡紫珍等、王德春等、陈玉村等通过大熊猫血液与人类ABO血型系统定型试剂的血清学反应结果，得到大熊猫红细胞血型类似人类O，Rh+型的结论[5-7]。但由于以上研究中并没有考虑到使用异源性定型试剂时，试剂中的种间抗体对于实验的影响，故异源性单、多克隆抗体在大熊猫红细胞定型实验中是否能发挥作用，还存在疑问。基于以上原因，本研究使用人类血型定型试剂对大熊猫红细胞进行检测并使用小鼠与人类血液、亚洲黑熊(Ursusthibetanus)血浆作为实验材料，对异源性试剂与大熊猫红细胞反应性进行实验，对历史文献中的结果及本研究中的实验结果进行验证。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验中所有实验流程按照AABB标准流程进行[9]。

1.1.1 血液来源及抗凝方法

本实验大熊猫血液样本采集自中国大熊猫保护研究中心的健康圈养大熊猫(2015年第一批次采样；2016年第二批次采样)，血液样本采集后使用EDTA·K2抗凝。

1.1.2 主要试剂及仪器

人类抗A抗B抗体及人类A，B，O试剂细胞、抗-M、抗-N、抗-D、抗-E、抗-e、抗-C及抗-c抗体购自上海血液生物医药责任有限公司；KA-2200血型离心机购自日本久保田公司，2420离心机购自日本久保田公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血液采集及分离

本实验涉及血液样品均通过中国大熊猫保护研究中心及上海市血液中心伦理审查。大熊猫全血血样来自中国大熊猫保护研究中心的圈养大熊猫，经行为训练后，所有血样采用非麻醉采血方式获得。使用10 mL及20 mL一次性针筒采血，采集到的大熊猫血样存放至5 mL EDTA·K2抗凝采血管中。小鼠血液来源为C57 bL/6小鼠，由本室杨启修实习研究员馈赠。人血浆为检验合格后的废弃血浆样品(O型及AB多人份混合；新生儿红细胞为单人份)，亚洲黑熊血浆由福州大熊猫研究中心馈赠。

所有抗凝全血获得后，按照AABB标准流程，通过离心2600 g，5 min对血浆和红细胞压积进行分离，红细胞压积使用生理盐水洗涤3次后(血清学离心机3档)被制作为2%～5%的红悬液进行下一步实验，血浆直接被用于检测。

1.2.2 血液配合实验(交叉配血实验)

使用红细胞悬液与血浆(异源性多克隆抗体)进行血液配合实验：红细胞悬液和血浆以1∶1比例混合，在室温条件下直接离心。使用血清学离心机2档离心，离心后对结果进行判读，判读标准如下(图1)。

IgM类异源性单克隆抗体(人类血清学血型试剂检测)：红细胞悬液和血型试剂以1∶1比例混合，在室温条件下直接离心。使用血清学离心机2档离心，离心后对结果进行判读，判读标准如下(图1)。

图1 血清学实验打分标准Fig.1 The scoring standard of agglutination strength in BCMTA：4+；B：3+；C：2+；D：1+；E：1+w；F：阴性(-)；G：混合视野(MF)；H：溶血A：4+；B：3+；C：2+；D：1+；E：1+w；F：Negative(-)；G：Mix field(MF)；H：Hemolysis

2 实验结果

在本实验中，使用了人类ABO血型系统定型试剂对2015年获得的11份大熊猫血样中的7例大熊猫红细胞进行了检测、使用MN血型系统定型试剂及Rh血型系统常见血型试剂对2016年获得的10例大熊猫红细胞进行检测；使用人类ABO系统标准试剂细胞对2015年获得的11份大熊猫血样中的7例获得的大熊猫血浆进行检测。发现大熊猫红细胞与抗-A、抗-B抗体剂均不发生凝集(表1)，而大熊猫的血浆与人类A型、B型血清学试剂细胞均发生凝集，与O型试剂细胞凝集略弱，与O型新生儿红细胞凝集最弱(图2)。大熊猫红细胞未与MN系统，Rh系统血型检测抗体反应(表2)。